具体设计规则
长度:合成的PNA序列通常不超过18个碱基,接头、氨基酸和标记物不计入此限。含有氨基酸:在序列的N端或C端可以添加一个赖氨酸或半胱氨酸。
嘌呤含量:富含嘌呤的PNA易发生聚合反应,并且水溶性差。为避免聚合反应,请遵循以下原则:将嘌呤含量限制在60%以下。例如,序列GATTAGCAGTCTACG是可行的(嘌呤含量<60%),而连续嘌呤应不超过4个,鸟嘌呤不超过3个。例如,ATTAGGGGCATCTAC(不可行,连续4个G)和CTAGATAGAAGGTTC(不可行,连续6个嘌呤)。如无法避免这些规则,可考虑使用探针的互补链。例如,GTAGATGCCCCTAAT(可行,上述序列的互补序列)和GAACCTTCTATCTAG(可行,上述序列的互补序列)。
避免自我互补序列:如反向重复、发夹和回文序列。由于PNA/PNA相互作用强于PNA/DNA,这类探针容易发生聚合。四个碱基互补是可行的,但仅限于除含C和G的情况外。当它们之间有一个或多个碱基间隔时也可行。例如,GATAATTGCA(可行,四个碱基互补),而GATCCGGTAC(不可行,只有CCGG互补),TATCCTGGTA(可行,CC与GG之间有一个碱基)。
六个及以上碱基的互补是不被允许的。例如,CTATTAATGCA(不可行,6个碱基互补)。但当间隔为一个或多个碱基时,六个碱基互补可行,除非只包含C和G。例如,AGTGCTACT(可行,有间隔)。至于GCGGCTCGC(不可行,仅G和C互补),即使有间隔,八个碱基互补也是不可行的。例如,ACTGTCAGT(不可行,8个碱基互补)。
一般规则
我们强烈建议设计反向平行的PNA探针。PNA可以向任一方向形成双链,但反向平行取向更为优先,形成常见的双链构造。在反义和DNA探针类型的应用中,反向平行是最优先考虑的构型。当取向为反向平行时,PNA探针的N端对应DNA的5’端。值得注意的是,PNA的熔点与DNA不同。由于PNA链是不带电的,PNA-DNA的Tm值通常高于对应的DNA-DNA。一般来说,在100mM NaCl条件下,每增加一个碱基,其Tm值会提高约1°C。在低盐浓度的环境下,Tm值差异更加明显。通常情况下,含10个碱基的PNA,其Tm值约为50°C,而含15个碱基的PNA Tm值约为70°C。最佳的PNA序列长度为12至17个碱基。序列长度主要依赖于具体的应用,与DNA应用相比,PNA探针所需的长度更短。根据序列,较长的PNA链容易聚合,不易进行纯化和表征,然而短序列具有更强的特异性,因此对于短序列而言,匹配失误的影响更显著。