胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)是来源于健康母牛怀孕4至8月龄胎牛的血液,经过无菌采集和多重筛选流程而制成,常用于多种真核细胞的培养中,为细胞提供必要的营养成分和生长因子。因此,它已成为各大实验室的“常客”。为了充分发挥胎牛血清的作用,确保细胞的健康状态,以下是一些实用的小建议,供实验人员参考。
一、如何解冻首次使用的胎牛血清?
胎牛血清通常在-20℃保存,若需长期存储,建议置于-80℃。解冻时,避免将其直接放置于常温(25-37℃),因为这样容易形成絮状沉淀,进而影响血清的品质。推荐的解冻方法是:首先将其从-20℃或-80℃转移至4℃,待完全化冻后,再转至室温。在解冻过程中,需定时轻轻摇晃瓶子,以帮助血清成分充分混合,减少沉淀出现。解冻后,可以将血清分装于无菌离心管中保存,若频繁使用,可以在4℃存放一管已解冻的血清,并尽量在一个月内用完。
二、血清的添加量应如何控制?
在细胞培养中,血清的添加量一般不宜过多,常见浓度为5%、10%或20%。大多数细胞在正常培养中使用10%的血清,而某些原代细胞在提取时可使用20%血清。具体的适用血清浓度应根据细胞的特性和实验目的进行调整。
三、热灭活的必要性
热灭活指的是在56℃下处理血清30分钟,以去活化补体。补体参与的反应包括溶细胞活性、平滑肌收缩等。通常而言,热灭活并非大多数细胞培养的必需步骤,经过此处理的血清对细胞生长的促进作用有限,甚至可能因高温降低血清质量,导致细胞生长速率减缓以及沉淀物增加。
四、更换血清的正确步骤
在细胞培养中,常常需要更换血清。直接将另一种血清的培养基替换过去,可能会导致细胞增殖速度突变或出现脱壁现象。这是因为细胞已经适应了原有的培养环境,更换营养环境(即使是更优质的血清)也可能引起不适应。通常建议采用逐步替换的方法:首次更换时将新旧血清按1:3的比例混合,接下来依次为1:1、3:1,最后完全替换。对于对培养环境敏感的细胞,替换比例应更精细调整。
五、关于解冻后出现的悬浮物
如果在解冻后发现少量乳白色絮状物或点状物,这通常是血清中的脂蛋白或纤维蛋白变性所引起的。这些絮状物不影响血清的质量,可以通过400×g离心5分钟后取上清使用,对细胞的影响也相对有限。
六、血清是否需要过滤处理?
一般情况下,生产厂家提供的血清都是无菌的,无需进一步过滤。如果发现血清中有悬浮物,可以将其与培养基一起过滤,但切记不要直接过滤血清。
七、观察到的黑点是否为污染?
如果在细胞培养过程中发现有黑点,首先应检查培养基是否混浊,黑点是否在无规则移动。污染细胞通常伴随着培养基迅速变黄和混浊,可能是细菌或支原体引起的。如果观察到的细胞生长状态良好,与黑点出现前无显著变化,黑点可能是已破碎细胞的残骸、血清中的杂蛋白或是培养基的水质问题。可以通过离心或过滤的方式去除这些黑点,部分原代细胞中的杂质在多次传代后可逐渐清除。
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